En nedbrytande lab….



MÅL: Er uppgift är att på ett tydligt, vetenskapligt och pedagogiskt sätt påvisa nedbrytning av:


a) proteiner

b) fetter

c) stärkelse


SAMT att karakterisera de enzymer som utför denna nedbrytning.




a) Nedbrytning av proteiner:

Ni får tillgång till:

¤ proteinlösning [1g/cm3]

¤ Pepsinlösning [1g/cm3]

¤ HCl [0,1M]

¤ Biuret-reagens för att påvisa polypeptider/proteiner


+ att ni får använda er av det som finns att tillgå i labbet! (exempelvis finns Pancretain)


b) Nedbrytning av fetter:

Ni får tillgång till:

¤ fett i flytande form (typ majsolja)

¤ Lipaslösning [1g/cm3]

¤ gallsalt-lösning [1g/cm3]

¤ superdetergent för tillverkning av kosmetika?

¤ NaOH-lösning [0,1M]

¤ pH-indikator, fenolftalein


c) Nedbrytning av stärkelse:


Ni får tillgång till:

¤ spottkopp (kan någon fixa plastmuggar?)

¤ stärkelselösning

¤ jodlösning

¤ Amylaslösning [1g/cm3]



risker:

laborationen innehåller starka baser och starka syror, samt färgämnen som kan färga kläderna. Sätt kork på provrör innan omskakning! Stoppa INTE fingrarna i munnen medan du är i lab-salen. Använd labrock.





Going deep...



a) Nedbrytning av proteiner:


Det finns MASSOR av exempel på YOUTUBE! Googla på YOUTUBE + Biurettest. Här är ett exempel på hur man kan läga upp en undersökning: “Digestion of proteins”: https://www.youtube.com/watch?v=F8F2AkerM8E

JAG tänker mig att ni utgår från den givna proteinlösningen [1g/cm3] och i olika provrör gör allt mer utspädda proteinlösningar genom att späda med vatten. Alltid slutvolym = 5ml!

JAG tillsatte 3 droppar HCl till alla rör (funkade bra)

JAG tillsatte 2 ml pepsin till varje rör (funkade bra)

Inkubationstid var ca 7-8 min i rumstemp.

Jag använde sedan mycket små provrör av glas för att påvisa protein med Biuret-testet.

10 droppar av proteinlösning blandades droppvis med Biuret-reagens.

3-4 droppar gav utslag i högsta proteinkoncentrationen! Jag bestämde mig för att tillsätta 10 droppar Biuret-reagens till varje provrör. Kork på innan omskakning av rören är ett måste, eftersom Biuret-reagens innehåller MYCKET NaOH!

(kolla receptet här: http://www.mystrica.com/Applications/Biuret#Method)

Resultatet blev en ganska tydlig färgskala från mycket rosa till helt färglös.

Kontrollen (enbart vatten, inget protein) blev svagt blå.


Sedan har vi det här med pH-värdet.... Pepsin arbetar ju bäst vid lågt pH-värde... Alltså kan man göra en studie av hur Pepsin arbetar i olika pH-värden! Utgå från en känd proteinlösning och variera antalet droppar HCl, innan tillsatts av given mängd Pepsin.


Slutligen har vi temperaturens inverkan. Man kan ta några ml pepsinlösning och koka det (kork på!) ett par minuter. Man kan ta några ml pepsinlösning och inkubera det i frysen ett par minuter. Pepsin vid rumstemperatur.... Pepsin efter inkubering i 60ºC ....-När funkar enzymet bäst?


(I läroboken står om proteiner på s. 16, 21-22, 111-112, 115)



b) Nedbrytning av fett:


Här börjar ni med att göra majsoljan basisk (tillsätt NaOH!) och rosa (tillsätt pH-indikatorn fenolftalein).

Ca 100 ml olja, magnetomrörare, ca 20 droppar NaOH och 20 droppar fenolftalein (NI MÅSTE TESTA ER FRAM!)


TANKEN är att då Lipas bryter ner fettet så frigörs fettsyror, vilka sänker pH-värdet, varvid den rosa färgen försvinner. Detta gör att Ni kan studera under vilka förhållanden Lipas bäst kan “göra sitt jobb”!


Eftersom fenolftalein blir rosa vid pH=8 –10 (färglös vid pH under 8!) så gäller det att inte tillsätta FÖR MYCKET bas (NaOH), eftersom att då blir pH-värdet så högt att de fettsyror som Lipaset eventuellt kan spjälka inte förmår sänka pH-värdet tillräckligt mycket för att ni skall kunna se effekten av enzymet! För att se om ni har “hamnat rätt” så tar ni 5 ml av er rosa fettblandning i ett provrör + 1 ml lipas, sätt tummen för och skaka (HÅLL JÄMN TAKT! SKAKA OCH SJUNG eller SKAKA TILL EN METRONOM) tills dess den rosa färgen försvinner! TIDEN för avfärgning bir ett mått på Lipasets effektivitet! Om färgen inte försvinner efter en minut avbryts försöket (klassas som “enzymet kunde inte göra sitt jobb”)


Utveckling av det feta försöket?


¤) Testa hur enzymet Lipas arbetar i närvaro av “galla”. Tag 5 ml av den rosa fettblandningen i ett provrör. Tillsätt 1 ml gallsalt, 1 % [w/v], skaka om och tillsätt snabbt 1 ml lipaslösning. Skaka tills dess den rosa färgen försvinner. Upprepa försöket minst två gånger!


¤) Testa hur Lipas reagerar på hög värme genom att ta några ml av Lipaslösningen i ett provrör, sätt på lock och utsätt det för riktigt varmt vatten i 10 minuter. Låt den uppvärmda Lipaslösningen svalna till rumstemperatur och testa därefter hur lång tid det tar för 1 ml av Lipaslösningen att avfärga 5 ml av den rosa fettblandningen.

Hade uppvärmningen någon effekt? Testa på samma sätt andra temperaturer.


¤) Testa att utsätta Lipas för olika pH-värden

Testar man effekten av t ex syra i 10 minuter, så tar man 2 ml av lipaslösningen och droppar i någon droppe HCl. Kolla pH! Efter 10 min tillsätter man lite bas, så att pH blir neutral igen. Sedan testar man enzymets aktivitet! (annars vet man inte om avfärgningen beror på lågt pH värde!)


(I läroboken står det om fetter på s 17-18 + 120 och om galla på s. 113)



c) Nedbrytning av stärkelse:

Här vill jag att ni först utser GRUPPENS MÄSTERSPOTTERARE! -Vem har det bästa salivet? -Vem har DET?


Mästaren utses på följande vis:


¤ Alla gruppdeltagre tilldelas en spottkopp i plast som märks med valfri “tag” eller personnamn.

Alla gruppdeltagare framkallar så mycket saliv de kan genom att under en minuts tid SIMULTANT massera spottkörtlarna (se bild nedan) och därvid arbeta aktivt med tungan i munnen. Spotta ut saliven i plastmuggen.

Obs! Viktigt att alla masserar spottkörtlarna på samma sätt under gurglingen! Träna helst lite “teknik” innan ni kör!


2) Alla gruppdeltagare tilldelas ett provrör med 5 cm3 blåfärgad stärkelselösning. Alla gruppdeltagare suger upp 1 ml av sin salivlösning i 1 ml plastpipett och tillsätter denna samtidigt till sitt provrör! Sätt omedelbart tummen för mynningen och skaka provröret (I SAMMA TAKT) tills dess den blå färgen är borta. Vinnaren (“mästerspottaren”) är den som först lyckas avfärga innehållet.

Obs! Viktigt att alla skakar provrören på samma sätt! Träna lite “skakteknik” innan ni kör! Hitta en gemensam rytm!


3) När “elitspottaren” är utsedd kan ni kasta alla andra salivlösningar. Nu skall ni bestämma amylasaktiviteten hos elitspottarens saliv genom att jämföra med kända amylaskoncentrationer.


4) Testa först tiden för avfärgning hos “mästerspottarens” saliv! Testa sedan tiden för avfärgning hos en “känd amylaslösning” 1 % [w/v] . Förhoppningsvis kan ni redan nu säga något om koncentrationen amylas i elit-salivet? (men antagligen måste ni späda mästarsaliven, ELLER amylaslösningen för att hamna på likvärdiga tider!)


5) Spädning (om nödvändigt?) av den kända Amylaslösningen: Utgå från den färdiga lösningen 1 % [w/v]. Gör sedan spädningar (1%, 0.8%, 0.6%. 0.4%. 0.2%, 0.1%, 0%) tills dess ni hamnar på samma tid som elit-salivet!

6) Häll upp ca 5 cm3 blåfärgad stärkelselösning i alla provrör. Viktigt att alla rör har samma volym! Testa tiden för avfärgning för en spädning i taget. Viktigt att samma person skakar provrören hela tiden! (gruppen behöver alltså “en skakare”). Tillsätt 1 ml amylaslösning, starta tidtagningen (gruppen behöver alltså “en tidtagare”) och skaka tills dess avfärgning sker. Om ingenting händer efter 1 minut avbryts skakningen.




Spottkörtlarna bildar saliv och enzymer

Man har tre par spottkörtlar som bildar totalt 1-1,5 liter saliv varje dygn. Körtlarna kallas

Öronspottkörteln är störst och ligger under huden framför och nedanför örat. Underkäksspottkörteln ligger längst in i underkäken, och tungspottkörteln i munhålans botten. Det finns även många små spottkörtlar i munnens slemhinna.

Saliv innehåller till största delen vatten. I vätskan finns upplösta salter och särskilda ämnen som har till uppgift att fortsätta sönderdela maten. Dessa ämnen kallas enzymer. Saliven förhindrar också att slemhinnan i munnen torkar ut samt skyddar munhålan och tänderna mot bakterieangrepp. Produktionen av saliv ökar reflexmässigt när man känner smaken eller lukten av mat, eller tänker på mat.

När den söndertuggade maten blandas med saliv blir den halvflytande och lätt att svälja.



I öronspottkörteln, underkäksspottkörteln och tungspottkörteln bildas saliv.




Bedömning:


¤ Redogöra för -och VISA!- principen bakom alla tre försöken: E


¤ Den vetenskapliga nivån på era undersökningar. “Praktiska arbetet” (E-A)


¤ Den vetenskapliga och pedagogiska nivån på presentationen av era resultat “rapporten” (E-A)


¤ Graden av självständighet i det praktiska arbetet???

I lab fungerar jag definitivt i min roll som handledare! Inga “avdrag” för att ställa relevanta frågor (exempelvis “var hittar jag det här?”, “Skulle det vara klokt att testa det här?”, “vad anser du om den här idén?” ). Däremot är det minus att fråga om sådant som du borde kunna, exempelvis genom att i förväg ha läst in dig på det undersökta enzymet och funderat på HUR enzymet kan karakteriseras på ett vetenskapligt och pedagogiskt sätt!